JDS：北京工商大学王蓓通过香气重组和遗漏研究表征酸奶酪（库鲁特）的主要气味物质

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北京工商大学王蓓通过香气重组和遗漏研究表征酸奶酪（库鲁特）的主要气味物质

导 读

2020年3月12日，北京工商大学食品与健康学院、北京市食品风味化学重点实验室王蓓等在Journal of Dairy Science（1区，IF：3.082）在线发表了题为“Characterization of the key odorants in kurut with aroma recombination and omission studies”的研究文章。

该文通过香气重组和遗漏研究表征酸奶酪（kurut，库鲁特）的主要气味物质，为了计算kurut的气味活性值，研究者还专门开发了一种新颖的Kurut基质，并进行了详细的重构和遗漏实验。这篇文章的思路，也是值得其他风味研究者借鉴，强烈推荐一读。

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DOI：10.3168/jds.2019-17521

文章背景：

Kurut（库鲁特）是一种白色或浅黄色的干发酵乳制品，具有独特酸味感。在中国，Kurut通常用新鲜的牛乳制成，具体工艺见图1。Kurut通常在10至20℃的开放环境中进行较长时间（2至5 d）的发酵。最初的制造过程与酸奶相似，但是在生产结束时，发酵会持续进行，直到Kurut自然凝结，然后排干乳清。然后，将凝乳制成圆形，块状为40至60g，直径为3至5cm。添加1.5％至3％（wt / wt）盐到Kurut凝乳中加以保存。最后，将Kurut片在阳光下干燥5至10d，其最终水分含量约为10％。

▲新疆奶酪-库鲁特（图片来自网络）

▲图1 中国新疆阿勒泰地区制作Kurut的过程

风味是决定奶酪品质的关键特征之一。大量研究论文描述了奶酪的挥发性特征，例如切达干酪，蓝纹奶酪和ewe乳酪。但是，很少有关于Kurut风味研究的研究。大多数与Kurut相关的论文都集中在微生物多样性或生产工艺。对Kurut中挥发性化合物的研究可以提供有关中国传统奶酪产品的重要信息。

研究思路：

这项研究的目的是确定与Kurut风味有关的挥发性化合物。（1）采用气相色谱嗅觉测定法（GC-O）和香气提取物稀释分析（AEDA）确定了Kurut最强的气味。（2）通过定量测量确定了由AEDA鉴定的关键香气化合物的气味活性值（OAV）。（3）为了评估在Kurut中识别出的强力气味的效果，研究者准备了重构和遗漏模型，并在感官实验中对其进行了评估。（4）开发了一种新颖的Kurut基质来确定OAV计算中的气味阈值，并进行了重构和遗漏实验。

研究路线：

■ 样品采集

3个Kurut样品（每个约300g ，由新疆阿勒泰地区的牛生乳原料制成，全部由3个当地牧民家庭手工制作）。奶酪制作过程如图1所示。收集所有样品，并在运输过程中保存在冰盒中。进入实验室后，样品立即保存在-80°C。

■ 样品处理

Kurut样品是根据Majcher和Jeleń（2011）描述的方法制备的，略改。为了获得代表性的样品，将3个样品表面剥离了大约1cm，然后将其切成小块并混合。将混合样品在液氮中冷冻并研磨以获得均匀的样品。

接下来，将100 g的磨碎的Kurut转移到锥形瓶中，环温，恒温振荡器（350 rpm），乙醚（200 mL）萃取7h。4°C，3,000×g离心15min，分离残留物质。为了进一步浓缩挥发性化合物，采用溶剂辅助风味蒸发（SAFE）方法进行了溶剂萃取。

■ 溶剂辅助风味蒸发（SAFE）

如Engel等人（1999）（点击阅读）所述，SAFE装置见图2，采用SAFE蒸馏Kurut的挥发性化合物。SAFE设备连接到接收管和废液管。然后将玻璃器皿连接到Edwards nXDS 6i旋片真空泵。采用循环水浴将SAFE设备恒温控制在40℃。将液氮倒入冷却阱和接收瓶中。在真空（〜10 -4 Pa）下蒸馏2h。蒸馏后，将馏出物用无水硫酸钠干燥过夜，然后使用Kuderna-Danish浓缩器浓缩至约1.0 mL。

▲图2  SAFE装置示意图

■ 相分离

为了消除高浓度的酸性化合物对其他挥发性化合物的影响，应用了相分离程序（Drake et al., 2010）。将浓缩的馏出物用 1mL 0.5M碳酸氢钠溶液洗涤3次并充分混合。每次洗涤后，除去作为馏出物水相的底层，并收集在单独的试管中。然后将浓缩的溶剂用1mL的饱和氯化钠溶液洗涤3次。每次将溶液充分混合，除去水相，并收集在同一试管中。收集剩余的层作为中性或碱性部分。通过用盐酸（18％wt / vol）酸化从浓缩的馏出物中收集的水层，将其酸化至pH值为2.0至2.5，从而回收酸性馏分挥发物。然后将酸化的样品用3 mL的乙醚萃取3次。将所有萃取物用无水硫酸钠干燥，然后在氮吹浓缩至0.5 mL。

■ GC-MS分析

采用Agilent 7890B / 5977A仪器进行了GC-MS分析。样品的浓缩级分（2.0μL）通过GC-O和GC-MS进行单独分析。采用连接了10μL直接进样针的PAL 3 RTC自动进样器进样。将化合物在DB-5和DB-Wax上分离。通过比较两根极性不同的色谱柱的质谱，保留指数和特征性香气与真实标准品来鉴定成分。在相同的色谱条件下，采用C7–C40正构烷烃系列计算保留指数。

■ 气相色谱-质谱/嗅觉（GC-MS/O）分析

通过GC-O和DB-WAX在毛细管柱上进行的AEDA分析，确定中性或碱性馏分和酸性馏分的风味物质稀释率（FD）因子。通过配备ODP2嗅探端口的GC嗅觉测定法检测气味活性区域。将萃取液用溶剂按体积逐步稀释2倍，以获得1：2、1：4、1：8等稀释度，然后将稀释液注入GC嗅觉计，然后分析稀释系列的每个样品直至在嗅探口没有明显的气味。

四个经验丰富的小组成员描述了GC嗅觉测定挥发物。每个小组成员在45 min的2个时间段内对样品进行一次评估，以避免疲劳。每个小组成员一式三份地重复所有分析。在实验之前，已经对这些小组成员进行了培训，包括嗅探57种参考化合物，这些参考化合物是由一些预先实验确定的有助于产生Kurut的风味；每种参考化合物均已准备好供小组成员使用，在纯溶剂（水或葵花油；Van Gemert, 2011）中，其气味阈值调节至其气味阈值的3至5倍。

■ 关键香气化合物的定量

定量通过SAFE获得的分离物，并将3-甲基戊酸（用于羧酸定量）和2-甲基-3-庚酮（用于其他化合物定量）用作内标。通过绘制目标化合物和相应内标物的响应比与浓度比的关系，绘制出单个挥发性香气化合物的标准曲线（Gao et al., 2014）。定量限（LOQ）和检测限（LOD）估计为产生10倍信噪比和3倍信噪比的标准分析物的浓度。选择性离子监测质谱仪用于定量香气化合物。   

■ 奶酪基质中气味检测阈值的测定

为了计算由AEDA鉴定的关键香气化合物的OAV，基于Czerny等人（2008）方法在Kurut基质中确定了它们的气味检测阈值。要求由10名小组成员组成的感官小组确定kurut基质中主要香气化合物的阈值。感官小组（6名女性和4名男性，平均年龄28岁）在嗅觉方面有经验。

阈值测定中采用的kurut基质的制备方法如下（Wang et al., 2018）：将牛奶浓缩蛋白粉（MPC 80）与超纯水混合并巴氏灭菌。将底物与凝乳酶（CHY-MAX Power NB）在37℃下反应直至其凝结。排出乳清后，将鲜凝乳作为Kurut的主要基质。

为了建立理想的基质系统，构建了Kurut基质来模拟其消费过程。将无臭的葵花籽油（脂肪相），超纯水（水相）和凝乳酶凝乳（蛋白质相）以与Kurut相同的浓度混合（Kurut：水= 1：1 wt / wt）。通过添加痕量的1％甲酸水溶液将Kurut基质系统的pH值调整为pH 4.0（Toelstede and Hofmann, 2008）。均质后，制备最终的kurut基质。

■ 描述性测试

要求在阈值测试中采用相同的感官小组来嗅探不同样品的风味特征。如表1所示，选择了由感官小组讨论的7种气味描述符作为描述Kurut整体香气的最相关的气味。要求评估者通过在5cm线性范围内对8个气味品质进行正交评估，将气味的强度定为“无”和“非常强”（Majcher and Jeleń, 2011），将其固定在两侧，强度为5 cm。将获得的结果对每种气味进行平均，并绘制在蜘蛛网图中。由单个评估员判断的值相差不超过20％。所有感官测试均在温度约为25℃的房间内进行。

■ 香气重构

以与用于阈值确定的Kurut基质相同的方式，准备了重构Kurut模型（RKM）的基质。作为参考，将kurut模型（KM）混合并用纯水稀释两次。然后，将30 mL RKM和30 mL KM放入玻璃容器（50 mL）中，并送至感官小组。在第一阶段，评估了RKM的香气特征。在第二阶段，评估了KM的香气特征。所有评估均重复三次。

■ 遗漏实验

根据Buettner and Schieberle（2001），进行了三角测试以确定某些化合物的重要性。为此，以与RKM相同的方式准备了16个遗漏模型，每次都省略一个或一组组分。同时向感官评估者提供了三个样本，包括1个遗漏模型和2个完全重构的模型。采用与重构实验相同的感觉小组，但是这次侧重是否可以检测到差异。

研究结论：

采用气相色谱嗅觉测定法和香气提取物稀释分析，从Kurut中鉴定出21种强力气味物质，其风味稀释系数范围为8至256。开发了Kurut基质，以确定Kurut中主要香气化合物的气味阈值。这21种有效的挥发性化合物的气味活性值表明，有18种浓度高于其气味阈值，因此有助于形成Kurut的整体香气。

通过将18种最重要的气味物质按浓度在Kurut中进行混合而制备的香气重组实验结果表明，重组样品的总体香气特征与Kurut非常相似。遗漏实验表明，酸类，呋喃类，酯类，酮类是Kurut最重要的挥发性化合物。一些香气化合物（例如丁酸，环高呋喃酮，己酸乙酯和丁酸乙酯）在Kurut的总体风味中起着最重要的作用。一些具有较高风味稀释系数的气味物质（例如硫化合物）可能影响不大。对Kurut主要香气化合物的研究可为研究和开发中国传统奶酪产品提供重要信息。

王 蓓

王蓓，1981年9月，博士，北京工商大学食品与健康学院食品科学与工程系副系主任，副教授，硕导

教育经历：1999年起就读于陕西科技大学生工学院生物工程专业，学士学位；2003年起就读于江南大学生工学院发酵工程专业，硕士学位；2005年起就读于江南大学食品学院食品科学专业，博士学位

工作经历：2010年6月—2012年10月 北京工商大学食品学院讲师；2012年10月-至今 北京工商大学食品学院副教授

主要研究领域：发酵乳制品风味及感官品质研究

主要学术成果：近年来，作为负责人主持并参与省部级以上科研项目包括国家自然科学基金8项， 863及科技支撑食品检测相关专项2项，农业部科技成果转化项目1项。此外还承担并参与了企业委托项目5项。申请发明专利7项，其中3项已授权，在国内外核心期刊上发表论文30余篇，近年来参与国际会议4次，做中国传统乳制品风味研究发展情况专题发言1次。2018年获得北京市高等教育教学成果奖一等奖1项（第三完成人）。

资料来源：

http://spxy.btbu.edu.cn/szdw/dszy/bssds1/71954.htm

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